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RNA-seq及其分析是近年來最火的研究方向之一，想要詳細了解RNA-seq的原理，最好先自行了解一下在此之前的各種測序技術(shù)，下面給出了測序技術(shù)的大致發(fā)展歷程。
測序技術(shù)發(fā)展：
1977Sanger測序--1996焦磷酸測序--2003cmPCR--2003ZMW---2012納米孔測序--now第二代測序(NGS)
第一代測序技術(shù)(Sanger測序)雖然有測序讀長(可達1000bp)、測序準確率(高達99.999%)的優(yōu)點，但是其測序成本高、通量(儀器一次測序產(chǎn)生的總數(shù)據(jù)量)低等缺點導(dǎo)致無法大規(guī)模應(yīng)用。
第二代測序技術(shù)(NGS)有測序速度快、測序成本低、準確性高的優(yōu)點，但其測序讀長比第一代測序技術(shù)要短很多(一般100-150bp)。目前illumina是NGS的主流公司(采用Hisq技術(shù))，其儀器的方法都是邊合成邊測序。
RNA-seq（RNA sequencing）是一種利用高通量測序技術(shù)來測定RNA樣本的方法，它可以提供關(guān)于轉(zhuǎn)錄組的詳細信息，包括mRNA、microRNA、lncRNA等不同類型的RNA分子的表達水平、剪接變異、融合轉(zhuǎn)錄本以及新的轉(zhuǎn)錄本等。以下是RNA-seq的基本步驟和技術(shù)原理：
樣本準備：
總RNA提取：首先從樣本中提取出總RNA，這一步通常需要使用商業(yè)化的RNA提取試劑盒。
rRNA去除：由于rRNA在總RNA中占比很大，因此通常需要去除rRNA以提高后續(xù)測序的效率。這可以通過多種方法完成，例如使用特異性引物的寡聚dT磁珠捕獲poly(A)+ mRNA或使用rRNA特異性探針進行雜交捕獲。
cDNA文庫構(gòu)建：
反轉(zhuǎn)錄：使用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)換成cDNA。
文庫片段化：如果需要，可以通過超聲波或酶處理將cDNA片段化。
接頭連接：在cDNA片段的兩端加上測序接頭，以便于后續(xù)的測序過程。
PCR擴增：通過PCR擴增文庫，增加文庫的拷貝數(shù)，同時也可以在此步驟中引入索引（index）以便進行多重測序。
測序：
使用高通量測序平臺（如Illumina、Thermo Fisher的Ion Torrent或PacBio等）對文庫進行測序。目前最·常用的測序技術(shù)是基于Illumina平臺的短讀長測序，可以產(chǎn)生幾十到幾百堿基長度的序列片段。
數(shù)據(jù)處理和分析：
原始數(shù)據(jù)質(zhì)控：對原始的測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量的reads。
序列比對：將測序得到的reads與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組比對，確定它們在基因組中的位置。
表達量化：根據(jù)比對結(jié)果，計算每個基因或轉(zhuǎn)錄本的表達水平，常用的方法有FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads) 或TPM (Transcripts Per Million)。
差異表達分析：比較不同條件下的樣本，找出差異表達的基因。
其他高級分析：還可以進行剪接變異檢測、新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測、非編碼RNA分析等。
整個RNA-seq流程涵蓋了從樣本處理到數(shù)據(jù)分析的多個步驟，每一環(huán)節(jié)都需要細致的操作和嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)處理。隨著技術(shù)的發(fā)展，RNA-seq已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄組研究中不·可·或缺的工具，廣泛應(yīng)用于生物學、醫(yī)學、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域。
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